Театр основан в апреле 1936 года, первый спектакль – "Каштанка" по рассказу А.П. Чехова, с использованием кукол, присланных Сергеем Образцовым. Труппа состояла из шести человек, руководителями были Е. Аша-Парфеньев и Н. Кузьменко. С 1937 года начались гастрольные поездки.

С начала 90-х годов XX века Омский "Арлекин" приобретает репутацию театра-экспериментатора. Его спектакли являются лауреатами множества премий и фестивалей, таких как международный фестиваль театров кукол, г. Плезень (Чехия), гран-при международных фестивалей кукольных театров "Золотая магнолия", г. Шанхай (Китай), национальная театральная премия "Золотая Маска" и других.

В 2009 году Омский государственный театр куклы, актера, маски "Арлекин" стал учредителем международного фестиваля театров кукол "В гостях у "Арлекина" – единственного мероприятия подобного уровня на территории Сибири. В 2017 году прошел V Фестиваль, на который прибыло 19 театров из 14 стран мира.

В 2005 году состоялся торжественный переезд театра в новое современное здание. Кроме большого зрительного зала на 230 мест, есть малый зрительный зал на 100 мест, и зал для самых маленьких на 40 мест с подушками вместо кресел.

Но деятельность театра не ограничивается спектаклями. На его базе регулярно проводятся выставки детского творчества, конкурсы, презентации, творческие встречи, тематические экскурсии, выставки авторской куклы омских художников. В театре есть зимний сад, и особая гордость – музей, фонды которого составляют афиши, фото, программы, режиссерские экспликации, эскизы и более 600 кукол из разных регионов России и зарубежья.

В марте 2015 года в театре прошло торжественное открытие бюста основоположнику омской школы кукловождения – Анастасии Кулишевой (Варжало), на протяжении почти двадцати лет бывшей главным режиссером театра.