После ухода Ризничего из капеллы показывается Анджелотти. Он знаком с художником и доверяет ему, а потому обращается с просьбой о помощи. Услышав голос Тоски, он прячется снова. Певица замечает сходство Магдалины с маркизой Аттаванти. Это сходство вызывает у Тоски взрыв ревности, но художнику удается ее успокоить. Тоска уходит, а Каварадосси предлагает беглецу спрятаться в его доме. Слышен пушечный выстрел, извещающий о том, что побег раскрыт. Мужчины спешат уйти.
Начинается торжественная служба. Среди молящихся появляются шеф полиции Рима Скарпиа и полицейский агент Сполетта. Их интересует капелла Аттаванти, где они, рассчитывая найти следы беглеца, обнаруживают веер, забытый маркизой, и пустую корзину из-под еды. Увидев возвратившуюся в церковь Флорию Тоску, которая надеялась снова встретиться с любимым, Скарпиа решает использовать ее в своих целях. Он искусно разжигает ревность Флории. Когда же она бросается вон из церкви, Скарпиа посылает за ней полицейских агентов в расчете на то, что разъяренная Тоска приведет их к тайному убежищу художника.