Иоланту томит неведомая ей доселе тоска. Она ищет утешение в беседе со своей кормилицей, Мартой, а ее подруги Бригитта и Лаура стараются развеселить ее песнями, приносят ей цветы. Марта поет своей питомице её любимую колыбельную, под звуки которой та засыпает.

Появляется Альмерик, оруженосец короля Рене; он объявляет привратнику замка, Бертрану, что вслед за ним сюда должен прибыть король со знаменитым врачом, который призван для исцеления Иоланты. Звуки труб возвещают приезд короля. Входит Рене в сопровождении мавританского врача Эбн-Хакиа. Король объясняет лекарю, что Иоланта с малолетства обручена с герцогом Бургундским Робертом и должна скоро вступить с ним в брак, но герцог не знает, что его невеста слепа, да и сама Иоланта не подозревает о своем недуге. Воспитав дочь в уединенном замке и окружив ее преданными людьми, король Рене под страхом смерти запретил открывать ей правду. Эбн-Хакиа возвещает, что исцеление Иоланты возможно только в том случае, если она сама страстно захочет обрести зрение. Короля терзает страх за судьбу дочери.

Герцог Бургундский Роберт и его друг, граф Водемон, заблудились в лесу и случайно вышли к саду Иоланты. Они восхищаются его красотой – сад словно по волшебству вырос среди дикой местности – и недоумевают, почему над входом помещена надпись, угрожающая смертью всякому, кто войдет сюда без разрешения. Роберт воспевает прелести своей возлюбленной Матильды. Ему невыносима мысль о том, что он обязан жениться на другой девушке. Роберт ни разу не видел свою невесту, но уверен, что не сможет забыть Матильду.

Рыцари видят Иоланту. Та, услышав незнакомые голоса, предлагает пришельцам отдохнуть и спешит принести им вина. Роберт хочет удалиться; но Водемон, поражённый небесной красотою незнакомки, остается. Он выражает Иоланте свое восхищение и просит ее подарить ему на память красную розу. Иоланта вручает ему розу, но белую. Водемон повторяет просьбу и снова получает белую розу. В душу рыцаря закрадывается подозрение. Он срывает несколько роз и просит Иоланту их сосчитать. Девушка отвечает, что для этого ей нужно взять цветы в руки. Теперь Водемон убежден, что Иоланта слепа. Он говорит с ней о зрении и свете; Иоланта утверждает, что, даже не видя мира, можно чувствовать его красоту и гармонию.

Слышны голоса: это король Рене, с ним врач и прислуга. Король Рене с ужасом узнает, что Водемон открыл Иоланте ее несчастье. В отчаянии он, наконец, решается предложить ей лечение Эбн-Хакиа. Иоланта не противится, но и не выказывает желания прозреть, и врач теряет надежду на счастливый исход своего лечения. Тогда король объявляет, что Водемон будет казнен, если Иоланта не прозреет. Испуганная Иоланта готова принять страдания, чтобы спасти Водемона, и умоляет врача исцелить ее.

Появляется Роберт, готовый спасать друга от неведомой опасности. Водемон открывает свою любовь к Иоланте, его невесте, и просит Роберта признаться королю, что он любит другую. Рене возвращает герцогу его слово и дает согласие на брак Иоланты с Водемоном.

Иоланта обретает зрение, и в горячей молитве все благодарят Бога за исцеление.